تغییر خواص الکتریکی سلول های سرطان پستان در انسان

سرطان پستان در انسان ها یکی از بیماری های شایع می باشد که شما عزیزان با دانستن اطلاعات کافی از این بیماری میتوانید جلوگیری کنید . شرکت توان زیست سپاهان ارائه دهنده انواع تخت بیمارستانی سعی دارد در این مطلب اطلاعاتی کامل از سلول های سرطان پستان ارائه دهد.

چکیده

مطالعه خواص الکتریکی سطحی سلول های بیولوژیکی، دانشی اساسی در مورد سطح سلول ها فراهم آورده است. تغییر در عملکرد بیولوژیکی سلول ها ممکن است در خواص سطحی تاثیرگذار باشد. این تغییرات را می توان توسط اندازه گیری الکتروکینتیک شناسایی کرد. چگالی سطحی فیبروبلاست ها و سلولهای سرطان پستان (MDA-MB 231 و MCF-7) به عنوان عملکرد pH توسط الکتروفورز اندازه گیری شد. تعامل بین یون های محلول و سلول های سرطان پستان یا سطح قیبروبلاست توسط مدل تعادل چهار جزئی توضیح داده شد. سازگاری بین منحنی تغییرات بار نظری و تجربی در سلول های سرطانی پستان و قیبروبلاست ها در pH2.5-9 خوب بود. میزان پراکسیداسیون لیپیدی فیبروبلاست و سلول سرطان سینه توسط اندازه گیری HPLC سطح مالون دی آلدئید تخمین زده شد. غلظت اسیدی (C_TA) و بازی (C_TB) گروه های عاملی و ثبات وابستگی متوسط به مقدار یون های هیدروکسیل (K_BOH) غشای سلول های سرطانی پستان نسبت به سلول های عادی بیشتر بود و این در حالی است که ثبات وابستگی متوسط به مقدار هیدروژن (K_AH) کمتر بود. سطح تولیدات پراکسیداسیون لیپیدی در سلول های سرطانی بیش از سلول های عادی بود.

مقدمه                            

بار الکتریکی غشای سلول پستاندارن در pH فیزیولوژیکی منفی است (1984 Holmes و Benga). حفاظت از ساختار غشایی و بار سطحی مناسب آن در فرآیندی که غشاء در آن درگیر است دارای اهمیت است. در بین این فرآیندها، مهم ترین آنها انتقال مواد معدنی و آلی سوخت و ساز بدن و تولیدات بوسیله پمپ های یونی، حمل کننده های غشایی، کانال ها و انتقال اطلاعات است (Nałe˛cz 1989).

هرگونه اختلال در کار سلول توسط تغییر در کار غشای سلولی آشکار می شود، یعنی در لایه الکتریکی آن. یکی از خصوصیات اصلی لایه الکتریکی دولایه بار الکتریکی آن است که امکان تغییر بوسیله زنوبیوتیک ها یا دگرگونی های متابولیکی را دارد. به این دلیل، مطالعات در مورد بار الکتریکی می تواند اطلاعات بسیاری در مورد تعادل موجود در غشاء و بین غشاء و محیط آن، هم در شرایط فیزیولوژیکی و هم در شرایط غیر فیزیولوژیکی فراهم کند (Szachowicz-Petelska و همکاران 2012، Gennis 1989، Dołowy 1984). بار غشایی سلول در خلال تومور زایی افزایش و در خلال نکروز کاهش می یابد (Dołowy 1984). تعیین بار الکتریکی غشا به عنوان تابعی از pH محیطی، غلظت اسیدی (C_TA) و بازی (C_TB) گروه های عاملی و ثبات وابستگی متوسط به هیدروژن (K_AH) و یا یون های هیدروکسیل (K_BOH) بررسی و نظارت تغییرات ناشی از تحولات سرطان را ممکن می سازد (Dobrzyn´ska و همکاران 2006).

مشهور است که سلول های نئوپلاستیک بدخیم دارای خواص سطحی متفاوت نسبت به همتایان عادی خود هستند. تعملات غیر سلول به سلول غیر عادی در سلول های بدخیم مهمترین رفتار در تمایز آنها از همتایان عادی خود و همچنین پیش بینی بیماری در بیماران مبتلا به سرطان هستند .

این مقاله مطالعه تغییر خاصیت الکتریکی غشای سلولی تحت تاثیر تحولات سرطان ادامه می دهد (Dobrzyn´ska و همکاران 2005؛ Szachowicz Petelska و همکاران 2010 ). ما تغییرات بار الکتریکی غشاهای سلولی ایجاد شده توسط تحولات سرطانی را در یک مطالعه آزمایشگاهی مورد بررسی قرار دادیم.

خطوط سلول سرطانی بهترین راه برای بررسی مکانیزم های تولید سرطان است و استفاده از کشت آزمایشگاهی در پژوهش دارای منافع بسیار مهمی است. بنابراین، هدف این مقاله تعیین خصوصیات الکتریکی غشا و سطح تولیدات پراکسیداسیون لیپیدی سلول های سرطان پستان (MDA-MB231 و MCF-7) و سول های عادی (فیبروبلاست) در انسان است. ما فکر می کنیم توصیف کمی خواص سطحی غشای سلولی می تواند به توضیح و درک فرآیندهایی که در سطوح غشایی بیولوژیکی در خلال تحول سرطان رخ می دهد کمک می کند.

نظریه

این مدل که تمام جزئیات آن در مطالعه پیشین ارائه شد (Dobrzyn´ska و همکاران 2006) فرض می کند وابستگی چگالی بار سطحی غشای سلولی به PH یک محلول الکترولیت با کمک چهار همترازی توصیف شود. دو همترازی از گروه های منفی با یون های سدیم و هیدروژن وجود دارد و دو همترازی از گروه های مثبت با یون های هیدروکسید و کلرید. یون های H⁺، OH^–، Na⁺ وCl^– در غشاء سلول و تعادل جذب سطحی (adsorption equilibria) جذب می شوند (فیبروبلاست ها، MDA-MB-3231، MCF-7) (معادلات 1-4) در فرم های زیر ارائه می شوند:

ثبات وابستگی یون های H⁺، OH^–، Na⁺ وCl^–  به گروه های عاملی با معادلات زیر بیان می شود:

که در آن ها K_AH، K_ANa، K_BOH و K_BCl ثبات وابستگی است؛ a_A^–، a_AH، a_ANa، a_B⁺، a_BOH و a_BCl غلظت سطحی گروه های متناظر در سطح غشاء است؛ و a_H⁺، a_Na⁺، a_OH^– و a_Cl^– غلظت های متناظر در محلول هستند.

چگالی بار سطحی (δ) بصورت زیر بیان می شود:

که در آن F=96,487  ثابت فارادی است.

تعادل غلظت گروه های عاملی بصورت زیر بیان می شود:

که C_TA غلظت کلی سطحی در گروه های اسیدی است C_TB غلظت کلی سطحی در گروه های بازی است.

حذف مقادیر a_A^–، a_AH، a_B⁺ و a_BOH از معادله بالا منجر به فرمول زیر می شود:

حل معادله 12 و تعیین  ثابت های K_AH، ، K_ANa، K_BOH و K_BCl  مشکل است. در مواردی که غلظت یون هیدروژن بالا یا پایین است معادله 12 را می توان بصورت یک معادله خطی ساده سازی کرد. در صورت غلظت بالای H⁺، صورت کسر هر عبارت در معادله 12 تقسیم بر مخرج آن می شود و فقط عبارت های اولیه باقی می مانند:

در مدل گرافیکی شیب و عرض مبدا می تواند به راحتی استخراج شود. در غلظت پایین یون H⁺ معادله 12 به ان ثورت ساده سازی می شود:

صورت در مخرج تقسیم شده و تنها عبارت اولیه باقی می ماند. این عملیات منجر به معادله خطی در دستگاه مختصات  و     می شود:

در مدل گرافیکی شیب و عرض مبدا می تواند به راحتی استخراج شود.

ضرایب تخمین زده شده از رگرسیون خطی را می توان برای تعیین C_TA، C_TB، K_AH و K_BOH استفاده کرد.  نقاط موجود در رگرسیون، هم در محدوده pH بالا و هم پایین باید به دقت انتخاب شود. تعیین مقدار این پارامترها اجازه محاسبه بار سطحی نظری غشای سلولی را در معادله 12 برای مقایسه با داده های تجربی می دهد.

مواد و روش ها

کشت سلول

فیبروبلاست معمولی پوست انسان، CRL-1474 و دو نوع سلول سرطان پستان، MCF-7 و MDA-MB-231 (بدست آمده از مجموعه کشت های نوع آمریکایی، مناسس، VA) در DMEN حاوی سرم جنین گاوی 10 درصد، پنی سیلین U/ml50،  انتی بیوتیکی بفرمول μg/m50 در یک فضای مرطوب با 5 درصد CO₂ و حرارت 27 درجه سلسیوس نگه داشته شد. تعلیق سلول ها (1×10⁶  سلول/ml ) در 6 میلی لیتر محیط کشت، با یا بدون ترکیبات آزمایش در پلیت های کشت سلول انکوبه شد.

پراکسیداسیون لپیدی

مقدار پراکسیداسیون لیپیدی در سلول ها بعنوان سطح سطح مالون دی آلدئید (MDA) بررسی شد. سطح MDA بعنوان واکنش محصول تراکم (condensation product reaction) اسید تیوباربیتوریک (TBA) با MDA ارزیابی شد که با استفاده از HPLC جدا شد. ما 0.75 میلی لیتر محلول اسید فسفریک (0.44 M) و 0.25 میلی لیتر محلول TBA تازه آماده (42mM) به 0.5 میلی لیتر عصاره رقیق شده سلول ها اضافه کردیم و این مخلوط برای 60 دقیقه در حرارت 100 درجه سلسیوس انکوبه شد. پس از خنک شدن، این مخلوط بوسیله 0.5 میلی لیتر مخلوط متانول 1-M-1M NaOH خنثی شد (45.5:45.5, v:v). پس از سانتریفوژ μl30  از محلول در ستون کروماتوگرافی (RP18) تزریق شد. جداسازی بوسیله شستشو ایزوکراتیک (40 درصد متانول، 60 درصد بافر فسفات، 7.0 pH) انجام شد. شناسایی بوسیله آشکارساز اسپکتروفلوریمتریک ( ، ) انجام شد. غلظت MDA بصورت نانومول TBA-rs در هر میلی لیتر عصاره سلول بیان شد.

روش الکتروشیمیایی

برای تعیین چگالی بار سطحی غشای سلولی، سلول ها در 0.015 M NaCl معلق شدند و در ظرف اندازه گیری قرار گرفت. سپس تحرک الکتروفورتیک به کمک دستگاه Zetasizer Nano ZS اندازه گیری شد. اندازه گیری ها به عنوان تابع pH انجام شد.

چگالی بار سطحی با استفاده این معادله تعیین شد  که در آن تحرک الکتروفورتیک،  ویسکوزیته محلول و ضخامت لایه انتشار است (Krysin´ski  و  Tien 1989).

ضخامت لایه انتشار بوسیله فرمول  بدست آمد که در آن R ثبات گاز، T دما، F عدد فارادی، I قدرت یونی NaCl 0.9 درصد و متوسط نفوذپذیری الکتریکی است.

تحلیل آماری

اطلاعات به دست آمده در این مطالعه به صورت Mean ± SD بیان شده است. داده ها با استفاده تجزیه و تحلیل آماری استاندارد، آنالیز واریانس یک طرفه با استفاده از آزمون F شفه، برای مقایسه چندگانه برای تعیین اهمیت بین گروه های مختلف، مورد بررسی قرار گرفت. P<0.05  حائز اهمیت در نظر گرفته شد.

نتایج و بحث

سلول های طبیعی دارای توانایی تبادل اطلاعات در داخل خود و بین سلول های دیگر هستند. هماهنگی اطلاعات توسط سلول های بدن در تنظیم و یکپارچه سازی توابع سلولی و رشد سلولها دخالت دارد.  هنگام بروز سرطان، سلولهای سرطانی دیگر توسط مکانیسم های کنترل عادی مهار نمی شوند. سلول های سرطانی همچنین دارای ویژگی های دیگری متفاوت با سلول های تکثیر طبیعی است. سلول های طبیعی در زمان رشد به خوبی سازماندهی می شوند، با همسایگان خود ارتباط قوی شکل می دهند و هنگامی که قسمت آسیب دیده را ترمیم کردند به دلیل مهار تماس با سلول های دیگر، رشد آنها متوقف می شود. سلول های سرطانی به راحتی جدا می شوند و نشان دهنده مهار تماسی رشد نیستند. سلول های سرطانی از علامت دهی بافت های عادی و مکانیزم های کنترل رشد مستقل می شوند. یعنی سلول های سرطانی با قسمت های دیگر بدن نا هماهنگ می شوند. چگالی بار سطحی غشای سلول (نظری و آزمایشی) به عنوان تابع pH در شکل 1 و 2 نشان داده شده است. اولی با نقطه و دومی با منحنی نشان داده شده است. مشاهده می کنید که وابستگی چگالی بار سطحی سلول های MDA-MB، MCF-7 و فیبروبلاست ها به pH در تمام سلول های مورد مطالعه شکل گرفته است. یک افزایش در چگالی بار سطحی مثبت سلول ها در مقادیر pH پایین تا زمان رسیدن به وضعیتی ثابت دیده می شود. با مقادیر pH بالا، بار منفی سلول نیز تا زمان رسیدن به وضعیت ثابت افزایش می یابد.

شکل 1: وابستگی چگالی بار سطحی فیبرو بلاست ها و غشای سلولی سرطان پستان (MDA-MB-231) به pH . مقادیر آزمایشی با نقطه و مقادیر نظری با خطوط نشان داده شده است.

شکل 2: وابستگی چگالی بار سطحی فیبرو بلاست ها و غشای سلولی سرطان پستان (MCF-7) به pH . مقادیر آزمایشی با نقطه و مقادیر نظری با خطوط نشان داده شده است

بار منفی در مقادیر pH بالا و همچنین بار مثبت در مقادیر pH پایین سلول های سرطان پستان انسان، با تغییری در نقطه ایزوالکتریک غشا به مقادیر pH پایین، بالاتر از این مقادیر در فیبروبلاست ها است (شکل 1 و 2).

محاسبات ریاضی بر اساس مدل چهار تعادل که توضیح دهنده جذب یون های الکترولیت در یک سطح غشای سلولی است، ارزیابی کمّی پارامترهای متمایز غشایی را ممکن می سازد. غلظت های کلی گروه های عاملی اسیدی (C_TA) و بازی (C_TB) در سلول سرطان پستان و همچنین سطوح فیبروبلاست و ثبات وابستگی متوسط آنها به یون های هیدروژن (K_AH) و هیدروکسیل (K_BOH) برا اسا معادله 13 و 14 محاسبه شد. ثبات های C_TA، C_TB، K_AH  و K_BOH منتج شده از این تعیین سازی در معادله 12 جایگزین شد که منجر به منحنی نظری شد. نقاط تجربی نمونه و منحنی های نظری در شکل 1 و2 نشان داده شده است. می توان مشاهده کرد که مقادیر آزمایشی و نظری چگالی بار سطحی سازگار است. مقادیر C_TA، C_TB و K_BOH غشای سلولی تغییر یافته بوسیله تحول سرطانی نسبت به سلول های عادی بالاتر بود اما مقدار K_AH  کمتر بود (جدول 1).

نشان داده شده است که تحولات سرطانی باعث تغییراتی در غشای دو لایه لیپیدی می شود (Punnonen و همکاران 1989؛ Szachowicz-Petelska و همکاران 2012). افزایش در محتوای فسفولیپید در سلول های سرطان پستان در انسان دیده شد (Sakai و همکاران 1992؛ Punnonen و همکاران 1989؛ Podo و همکاران 2007). افزایش محتوای فسفولیپید ممکن است نتیجه افزایش سنتز غشاء سلول که با تکثیر سلولی نئوپلاسم شتاب دار مرتبط است باشد (Ruiz-Cabello و Cohen 1992). افزایش میزان فسفولیپید منجر به تعداد بالای گروه های عاملی می شود : گروه های آمینو، کربوکسی و فسفات. در محیط اسیدی (pH) پایین بار فسفولیپیدها عمدتا ناشی از گروه های آمینو است اما در محیط بازی( pH بالا) ناشی از گروه های کربوکسی و فسفات است. افزایش میزان فسفولیپیدها می تواند چگالی سطحی گروه های دارای بار منفی غشای سلول های سرطان پستان را در مقدار بالای pH و چگالی سطحی گروه های دارای بار مثبت در pH پایین را افزایش دهد.

هیپوکسی/ترکیب دوباره با اکسیژن و خاصیت اسیدی، موجب تاثیر گذاری فسفولیپیدهای آنیونی و به احتمال زیاد فسفاتیدیلسرین و فسفاتیدیل اتانل آمین شد (Zhao و همکاران  1998؛ Ran و همکاران 2002). طبق مطالعات پیشین، هم هیپوکسی و هم اسیدیته می تواند در یک تومور وجود داشته باشد. بویژه هیپوکسی نشان دهنده یک عامل استرس زای مهم سلولی است که می تواند موجب یک برنامه ابقاء بوسیله تلاش سلول ها برای انطباق با محیط جدید شود. بطور معمول این سازگاری ها بر متابولیسم سلول  و/یا تحریکِ توزیع اکسیژن به شدت تحت تاثیر می گذارد (Bos و همکاران 2004).

جدول 1: C_TA، C_TB ، K_BOH و K_AH فیبروبلاست ها و غشای سلول های سرطان پستان (MDA-MB-231، MCF-7)

بار غشای سلولی همچنین بوسیله اسید سیلیاک موجود در گلیکولیپیدها و گلیکوپروتئین ها تحت تاثیر قرار می گیرد. تصور این است که اسید سیلیاک بر غلظت سطحی گروه های اسیدی و بازی و همچنین ثبات وابستگی گروه های مثبت و منفی در خلال تحول سرطان تاثیر می گذارد.

جدول 2: سطوح مالون دی آلدئید محصول نهایی پراکسیداسیون لیپیدی (MDA, nmol/mg) در فیبروبلاست و سلولهای سرطان پستان. در مقایسه با فیبروبلاست ها p<0.05

افزایش محتوای اسید سالیسیک در گلیکولیپیدها و گلیکوپروتئین ها بوسیله داده های تحقیقی مورد تایید قرار گرفته است (Narayana1994؛ Jakielaszek و همکاران 1986). افزایش محتوای اسید سالیسیک می تواند افزایش غلظت سطح گروه های اسید را تحریک کند.

جدوا 2 نشان دهنده تغییر در MDA محصول نهایی پراکسیداسیون لیپیدی که توسط HPLC به عنوان مشتق TBA است. سطح MDA بطور چشمگیر در سلول های سرطان پستان (MDA-MB-231,MCF-7) نسبت به سلول های معمولی بالاتر بود (جدول 2).

پروتئین ها و لیپیدهای غشایی همچنین ممکن است گونه های اکسیژن واکنش پذیر (ROS) که نتیجه تحول سرطانی هستند تغییر کند (Gago-Dominguez و همکاران 2007؛ Skrzydlewska و همکاران 2005). ROS محرک (به اصطلاح) پراکسیداسیون لیپید است. در نتیجه مولکول فسفاتیدیلسرین که بطور فیزیولوژیکی در قسمت داخلی غشاء قرار دارد در قسمت بیرونی ظاهر می شود. ظاهر شدن مولکول فسفاتیدیلسرین در قسمت بیرونی غشاء باعث می شود یک گروه اضافه با بار منفی در آنجا ایجاد شود. وجود گروه ها عاملی اضافه فسفاتیدیلسرین ممکن است منجر به کاهش ثبات وابستگی گروه های با بار منفیِ غشاء و افزایش افزایش ثبات گروه های با بار مثبت شود زیرا مقدار K_AH کمتر و مقدار K_BOH بیشتر از این مقادیر در گروه های اصلی غشاء سلولی است.

واکنش آلدئیدها تولید شده در طی پراکسیداسیون لیپیدی با باقی مانده اسید آمینه پروتئین ها  ممکن است به تغییر اکسیداتیو آنها منجر شود. در این فرآیند، محصولات نهایی پراکسیداسیون لیپید مانند MDA و همچنین دیگر محصولات منتج شده از آسیب اسید چرب اشباع نشده می تواند باعث تجزیه پروتئین شود (Esterbauer و همکاران 1991).

تجمع یا تکه تکه شدن، می تواند نتیجه نهایی تغییر اکسیداتیوپروتئین ها باشد (Davies و همکاران 1987؛ Du و Gebicki 2002). تکه تکه شدن پروتئین باعث ایجاد گروه های عاملی افزایشی می شود، هم اسیدی و هم بازی. این فرآیند همچنین می تواند باعث ظاهر شدن گروه های عاملی فسفولیپید غشایی می شود. تغییرات ممکن است همانطور که توسط این مقاله تایید شد منجر به مقادیر بالای C_TA و  مقادیر پایین تر C_TB شود.

داده ها حاکی از این است که خواص الکتریکی سلول های سرطان پستان با خواص الکتریکی سلول های عادی متفاوت است. ثابت های C_TA، C_TB، K_AH  و K_BOH برای بررسی تغییرات ناشی از تحولات سرطانی مناسب هستند. بنابراین، بررسی پارامترهای متمایز غشای سلول های سرطانی هستند ممکن است عامل مهمی در مطالعات آینده بیولوژی سرطان باشد.

برای دریافت فایل زبان اصلی مقاله بر روی لینک کلیک کنید.